導讀
增殖細胞核抗原（PCNA）是存在於所有真核細胞中的一種進化保守的多面蛋白，在 DNA 合成和 DNA 修復中發揮著關鍵作用。PCNA 圍繞 DNA 形成一個同型三聚體環狀結構，作為複製體的中心「樞紐」，能夠錨定許多參與複製和修復途徑的蛋白質。一直以來，PCNA 被廣泛用作腫瘤進展的標記物。不過最近的研究表明，PCNA 可以發揮有絲分裂作用，通過細胞外囊泡遠端恢復衰老細胞。
DNA 複製壓力是癌細胞的一個標誌。利用這種與癌症相關的特徵，通過引入進一步的 DNA 損傷可以導致癌細胞的死亡，因此它被用作主要的抗癌治療策略。與癌細胞相關的一種獨特的 PCNA 亞型的鑑定，可能為新的化療藥物的開發開闢了一條新的途徑。前期的研究已經發現了幾個靶向 PCNA 的分子，包括小分子和基於肽的分子，這表明直接靶向 PCNA 治療癌症可能是一種可行的方法。
2023 年 8 月 1 日，，美國最大的癌症研究和治療組織之一——希望之城貝克曼研究所等單位的研究人員在Cell Chemical Biology雜誌發表了題為Small molecule targeting of transcription-replication conflict for selective chemotherapy的文章，通過合理的藥物設計方法，他們發現了一種小分子 PCNA 抑制劑 AOH1996，它可以在臨床前研究中選擇性地殺死所有類型的癌細胞。
在機制層面，他們發現 AOH1996 增強了 PCNA 與 RNA 聚合酶 II 最大亞基 RPB1 之間的相互作用，並將 PCNA 從轉錄活躍的染色質區解離，同時以轉錄依賴的方式誘導 DNA 雙鏈斷裂。AOH1996 能夠作為抑制腫瘤生長的單一療法或聯合治療，並且沒有明顯的副作用。在動物研究中，它幾乎完全抑制異種移植瘤的生長，並使它們對拓撲異構酶抑制敏感。
本研究的結果首次證明了 PCNA 和 RBP1 相互作用產生了癌症選擇性易感性，這可以在臨床前模型中很容易觀察到。AOH1996 作為一種化學工具的潛在用途，進一步定義細胞中的轉錄-複製衝突（TRCs），並清楚地證明了 AOH1996 作為單一療法時的治療潛力，以及它與現有的化療聯合使用時的治療潛力。
圖片來源：Cell Chemical Biology
主要研究內容
AOH1996 可靶向 PCNA
前期，該團隊報道過一種 PCNA 配體 ——AOH1160，它可以靶向 PCNA 的癌症特異性 L126-Y133 區域，並對癌細胞具有選擇性毒性。在本研究中，他們基於 PCNA 與其潛在配體之間的相互作用，通過使用建模工具，設計併合成了大約 70 種 AOH1160 類似物，並從中鑑定了一種類似物 AOH1160-1LE，預測其溶解度顯著增加；鑑定到的另一種類似物為 AOH1996，這是通過在末端苯基環的側位上添加甲氧基得到的。為了證實 AOH1160-1LE、AOH1996 與 PCNA 的結合，他們進行了熱變性分析，結果發現他們與 PCNA 的穩定相互作用。
在 PCNA 同型三聚體的鏈 A 和鏈 B 中，中心的 AOH1160-1LE 分子與 PIP 盒結合腔近似垂直於結合腔。在 AOH1996-1LE（AOH1996 類似物）晶體結構中也觀察到三個結合分子，並容納了額外的甲氧基基團，使 AOH1996-1LE 的結合模式與 AOH1160-1LE 的結合模式相似。
圖片來源：Cell Chemical Biology
AOH1996 的優良治療特性
基於 AOH1996 的靶標（caPCNA）在癌細胞中的廣泛表達，研究人員在 70 多個癌細胞系和幾種正常對照細胞中進行了檢測。結果發現AOH1996 可以選擇性地殺死癌細胞；相比之下，AOH1996 對非惡性細胞沒有明顯的毒性。
AOH1996 誘導了細胞週期譜的實質性變化，表明癌細胞中 G2/M 或 S 期停滯。此外，通過流式細胞術和 TUNEL 檢測的陽性反應，表明 AOH1996 在癌細胞中誘導了細胞凋亡；但 AOH1996 不會顯著改變非惡性神經嵴幹細胞的細胞週期，也不會誘導其凋亡。
此外，AOH1996 還增加了癌細胞對包括順鉑在內的基因毒性藥物的敏感性。在 AOH1996 和拓撲替康之間也觀察到了類似的協同作用，拓撲替康是一種拓撲異構酶 I 抑制劑，可以阻止拓撲異構酶 I 重新連接被切割的 DNA 鏈，從而在 DNA 複製過程中導致雙 DNA 鏈斷裂（DSB）。
圖片來源：Cell Chemical Biology
隨後，他們檢測了 AOH1996 在小鼠體內的抗癌活性，小鼠體內的腫瘤來源於神經母細胞瘤或乳腺或小細胞肺癌細胞。與對照組相比，每日 AOH1996 治療顯著降低了動物的腫瘤負擔，並且 AOH1996 沒有造成任何死亡或顯著體重下降。此外，在小鼠實驗中，AOH1996 的無觀察不良反應水平（NOAEL）為 250 mg/kg/劑量，每日兩次。
為了確定藥效學標記物，他們使用免疫組化方法分析從使用 AOH1996 或只使用載體的小鼠身上採集異種移植瘤。局灶性 gH2A.X 染色和 phospho-Chk1 僅在 AOH1996 治療的腫瘤中可見。總的來說，AOH1996 治療小鼠的腫瘤密度低於對照組小鼠。這些結果與 AOH1996 在癌細胞中引起 DSB 和 G2/M 阻滯的觀察一致，並證明了 gH2A.X 染色和 phospho-Chk1 可以作為其臨床藥效學標誌物。
圖片來源：Cell Chemical Biology
調節 PCNA 與轉錄機制的相互作用
PCNA 與其結合伴侶相互作用的免疫沉澱和質譜分析顯示，與染色質結合的 PCNA 相關的超過 50% 的蛋白被 AOH1996 改變，這些蛋白是細胞轉錄過程的組成部分。進一步的免疫沉澱研究發現，AOH1996 增強了癌細胞中 PCNA 和 RPB1 之間的相互作用，並使 RPB1 減少。後續的實驗還表明 AOH1996 增加了轉錄-複製衝突（TRC），增強了 RPB1 與 PCNA 之間的相互作用。通過檢測全細胞提取物中外源表達 RPB1 的水平，他們發現AOH1996 以蛋白酶體依賴的方式引起野生型 RPB1 的降解。
圖片來源：Cell Chemical Biology
他們還利用 CRISPR 在人神經母細胞瘤細胞系 SK-N-AS 中將 RPB1-418 位點的酪氨酸突變為丙氨酸。Y418A 突變等位基因的純合子細胞對 AOH1996 生長抑制的敏感性顯著低於親本細胞。質譜和基因本體（GO）富集分析表明，在 AOH1996 處理後的兩個細胞系中，參與細胞週期調控和 DNA 複製和修復的蛋白佔了 54 個差異蛋白中的 49 個，這些蛋白的水平至少改變了 2 倍，且具有統計學意義。AOH1996 處理引起的大部分變化在親本細胞中要比在 RBP1 突變細胞中高得多，再次表明 AOH1996 發揮作用，至少部分是通過調節 PCNA 與 RPB1 的相互作用。
圖片來源：Cell Chemical Biology
結語
總的來說，該研究開發了一種靶向 PCNA（增殖細胞核抗原）的抗癌小分子藥物 AOH1996。臨床前研究結果顯示，在 70 多個癌細胞系和幾組正常細胞中，AOH1996 可以選擇性地殺死所有類型的癌細胞；且 AOH1996 對正常細胞沒有明顯的毒性。
該研究證明了這種先導化合物的治療潛力，抑制轉錄-複製衝突的解決可能為選擇性殺死癌細胞開闢了一種新的治療途徑。據悉，該藥物已進入 I 期臨床試驗。
未經處理的癌細胞（左）和用 AOH1996 處理的癌細胞（右）正在經歷程序性細胞死亡（紫色）（圖片來源：City of Hope）
本研究通訊作者Linda H. Malkas教授說到：「PCNA 就像一個主要的航空樞紐，包含多個飛機登機口。資料表明，PCNA 在癌細胞中發生了獨特的改變，這一事實允許我們設計一種只針對癌細胞中 PCNA 形式的藥物。我們的抗癌藥物就像一場暴風雪，關閉了一個關鍵的航空樞紐，使所有攜帶癌細胞的航班停飛。我們目前的結果很令人興奮，在細胞和動物模型中，AOH1996 可以作為單一療法或聯合療法抑制腫瘤生長而不產生毒性。這種實驗性化療藥物目前正在希望之城進行 I 期臨床試驗。」
該研究第一作者Long Gu說：「從來沒有人把 PCNA 作為一種治療手段，因為它被視為『無藥可治』，但很明顯，希望之城能夠針對具有挑戰性的蛋白質靶點開發出一種實驗性藥物。我們發現，PCNA 是癌細胞中核酸複製錯誤增加的潛在原因之一。現在我們知道了問題所在，並能夠抑制它，我們將更深入地了解過程，以開發更個性化、更有針對性的癌症藥物。」
值得提醒的是，儘管該藥有著如此強大的功能，並被稱為「超級抗癌藥」，但目前該藥仍處於臨床前研究。
8 月 3 日，哈爾濱血液病腫瘤研究所所長、中國臨床腫瘤學會（CSCO）創始人及監事長馬軍教授在採訪時表示：「從臨床來看，一款好的腫瘤藥要看其有效性和安全性，目前 AOH1996 的研究結果來自臨床前期，雖然帶來了腫瘤治療的新希望，但仍需要二三期臨床試驗諸多環節的證實。目前來看，腫瘤治療沒有『神藥』。」
深圳市第三人民醫院院長盧洪洲也提到：「AOH1996 雖然在細胞模型和動物模型的臨床前研究中證實其安全性和有效性，但是該藥物是否能夠在後續的 I/II/III 期臨床試驗達到預設研究終點，是否能夠表現出優異的安全性和有效性，我們還需持謹慎態度，需要等臨床試驗資料發佈再行判斷。」
圖片來源：City of Hope
參考文獻：
1. Gu et al., Small molecule targeting of transcription-replication conflict for selective chemotherapy, Cell Chemical Biology (2023).
2. Hanahan, D., and Weinberg, R.A. (2011). Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 144, 646–674.
3. Lei, Q., et al. (2021). Extracellular vesicles deposit PCNA to rejuvenate aged bone marrow-derived mesenchymal stem cells and slow age-related degeneration. Sci. Transl. Med. 13, eaaz8697.