撰文 | 木蘭之枻
CRISPR基因編輯技術正成為遺傳病臨床基因治療的強力武器。此外，該技術在腫瘤免疫治療領域同樣展現出巨大的應用潛力，並已在多項腫瘤免疫治療的臨床研究中用於T細胞改造和CAR-T細胞的製備。雖然應用前景廣闊，但CRISPR技術仍存在多種安全風險：研究者發現，人胚胎或細胞中利用CRISPR技術進行基因編輯常會導致染色體大片段缺失（NBT丨CRISPR編輯技術面臨新的安全隱患——胡家志點評；Cell特別關注 | CRISPR編輯人類胚胎存在高風險——導致染色體大段甚至整體缺失）【1-3】。此外，CRISPR技術的應用會激活p53而導致DNA損傷，而活化的p53則會抑制CRISPR-Cas9系統的基因編輯效率（兩篇Nat Med致CRISPR股票大跌，這回是因為p53；NBT丨CRISPR編輯技術面臨新的安全隱患——胡家志點評）【4-5】。人胚胎幹細胞以及其他類型細胞中的研究還發現，Cas9蛋白能直接結合DNA-PK複合物而干擾DNA修復通路，甚至增加染色體碎裂風險（特別關注丨 CRISPR-Cas9系統的新風險——破壞DNA-PK依賴的修復通路引發DNA損傷；；Nat Genetics | 增加染色體碎裂風險？–CRISPR-Cas9基因編輯技術安全性再遭質疑）【6-7】。以上研究都提示我們， CRISPR技術的臨床應用研究仍有許多安全問題有待解決。
2023年10月3日，來自加州大學柏克萊分校的Jennifer A. Doudna實驗室與Chun Jimmie Ye實驗室合作在Cell雜誌上發表題為Mitigation of chromosome loss in clinical CRISPR-Cas9-engineered T cells的論文。研究指出，T細胞改造以及CAR-T製備過程中，CRISPR技術普遍會導致染色體大片段或整體缺失這一嚴重的安全風險。通過最佳化T細胞製備流程，研究者可在保證CRISPR基因編輯效率的同時，成功降低了染色體整體缺失的安全風險。
前期研究指出，敲除TRAC基因 （T細胞受體α連結串列達基因） 可避免移植物抗宿主反應 （GvHD），這對通用型CAR-T的開發有巨大價值。不過有研究發現，採用CRISPR技術敲除TRAC基因易導致染色體異常，但染色體異常出現的頻率、嚴重程度、相關機制及改進策略仍缺少研究。為對CRISPR技術導致染色體異常進行系統性分析，本研究一開始便以TRAC基因為靶點，採用電轉染和spCas9-gRNA核糖核蛋白 (RNP) 複合物對人原代T細胞進行基因編輯。結果顯示，TRAC基因的整體敲除效率為62%-97%，這證實了CRISPR技術的有效性。不過單細胞測序（scRNA-seq）和生物資訊學分析指出，約有5%-20%的T細胞會出現14號染色體（TRAC基因所在染色體）的大片段或整體缺失；後續的ddPCR實驗同樣證實，TRAC基因敲除會導致約4%-22%的T細胞出現染色體大片段缺失。機制研究提示，CRISPR技術敲除基因時導致的DNA雙鏈斷裂（DSB）是導致染色體大片段缺失的關鍵。
為驗證CRISPR技術導致染色體缺失這一安全風險的普遍性，研究者採可覆蓋所有染色體的gRNA文庫（共384條gRNA，92種靶基因，3-7靶基因/染色體）進行CRISPR篩選並通過CROP-seq實驗分析染色體的缺失情況。結果顯示，55%的gRNA都會導致染色體缺失，且任一種染色體都可能因基因編輯導致染色體的大片段或整體缺失。研究還發現，靠近染色體著絲粒位置的gRNA更容易導致染色體缺失。
隨後研究者通過轉錄組測序對染色體缺失導致的基因表達異常進行了分析。結果顯示，Cas9誘導的染色體缺失會導致多種基因表達異常，且這種表達異常與靶基因敲除並無直接相關性。研究還發現，Cas9誘導的染色體缺失會導致p53相關的DNA損傷應答、細胞凋亡通路活化以及p53誘導的細胞週期停滯。這表明Cas9誘導的染色體缺失會損害T細胞存活優勢。後續的細胞存活和增殖實驗進一步證實，Cas9誘導的染色體缺失導致了T細胞存活和增殖能力下降。
CRISPR技術除用於基因敲除外，還被廣泛用於同源重組（HDR）介導的突變修復和DNA片段定向插入。研究發現，CRISPR技術用於HDR介導的DNA片段定向插入時同樣會導致染色體缺失。此外，CRISPR技術用於臨床前CAR T細胞製備時也導致了明顯的染色體缺失。然而令人意外的是，在CRISPR療法首次用於人體試驗的1期臨床研究NCT03399448中，CRISPR技術改造後的NYCE T細胞並無明顯的染色體缺失。為分析導致臨床研究與實驗室結果差異的機制，研究者對兩種條件下CRISPR技術改造T細胞的流程進行了一一比對。結果發現，實驗室研究時，研究者首先對T細胞開展活化/激活處理，之後才進行Cas9介導的基因編輯；而臨床研究中，研究者首先對T細胞進行Cas9介導的基因編輯後才開展活化/激活處理。隨後研究者證實，T細胞活化與Cas9基因編輯的順序差異是導致染色體缺失的關鍵因素之一。更深入的分子機制研究指出，p53表達差異是關鍵：T細胞活化會導致p53表達水平降低，而Cas9介導DSB發生時的p53表達水平與T細胞染色體缺失的發生頻率負相關。
本研究指出，CRISPR基因編輯導致的DNA雙鏈斷裂（DSB）和細胞內的p53表達水平是導致染色體缺失的關鍵因素。通過調整CAR T細胞製備流程，改變T細胞活化與Cas9基因編輯的順序，研究者可在保證基因編輯效率的同時有效降低染色體缺失的頻率。總體而言，這一研究讓人們對CRISPR技術導致染色體缺失的安全風險有了系統性的認識，而新的改進方案對提升CRISPR技術在臨床應用中的安全性有重要指導意義。
原文連結
https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.08.041
製版人：十一
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